to incubate

WE USE 25 ML GLASS CONICAL REACTI-FLASKS (PIERCE, CODE 13320) WITH SCREW CAPS. WE JUST HAPPEN TO HAVE A LOT OF PIERCE STUFF IN THE LAB. HOWEVER PIERCE NOW PART OF THERMO SCIENTIFIC. NO IDEA IF THESE VIALS CAN BE BOGHT NOW. YOU JUST NEED SOMETHING TO INCUBATE THE CHOPPED LIVERWITH THE COLLAGENASE. WE USE THESE FLASKS BECAUSE THEY FIT IN THE WATER BATH SHAKER WE HAVE.

WIR VERWENDEN SCHRAUBVERSCHLÜSSE 25 ML GLAS KONISCH REACTI-FLASCHEN (PIERCE, CODE 13320). WIR ZUFÄLLIG EINE MENGE SACHEN PIERCE IM LABOR HABEN. DURCHBOHREN SIE JEDOCH JETZT TEIL VON THERMO WISSENSCHAFTLICHE. KEINE AHNUNG, OB DIESE FLÄSCHCHEN BOGHT JETZT SEIN KÖNNEN. SIE BRAUCHEN NUR ETWAS ZU DEN GEHACKTEN LIVERWITH BRÜTEN DIE COLLAGENASE. WIR VERWENDEN DIESE FLASCHEN, WEIL SIE IN DEN WASSER-BAD-SHAKER PASSEN, DIE WIR HABEN.

Nanoliposome solutions were stored at 4°C until use, protected from light when necessary. To prepare siRNA- or plasmid-loaded cationic nanoliposomes, siRNA or plasmid DNA, was aliquoted into 0.9% NaCl and nanoliposomes were added in a 10:1 weight ratio to nucleic acid. The solution was allowed to incubate overnight at room temperature prior to use. The RNA interference sequences utilized (Table 2), were from the ON-TARGET plus SMART pool product line of Dharmacon (Lafayette, CO).

Nanoliposome Lösungen wurden bei 4 ° C bis zur Verwendung und vor Licht geschützt, wenn notwendig. Um siRNA-oder Plasmid-geladenen kationischen nanoliposomes, siRNA oder Plasmid-DNA herzustellen, wurde in 0,9% NaCl und nanoliposomes aliquotiert wurden im Verhältnis 10:1 Gewichtsverhältnis Nukleinsäure zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren vor der Verwendung. Die RNA-Interferenz-Sequenzen verwendet wird (Tabelle 2), waren von der On-Target sowie SMART-Pool-Produktlinie von Dharmacon (Lafayette, CO).

Cellular viability assay. SH-SY5Y, U-87 MG or LN-18 cells were seeded in 96-well tissue culture dishes (5 x 103 cells per well) and grown for 48 hours. Cultures were co-incubated with pharmacological inhibitors and either 100 ng/ml TNFα or 5 μg/ml doxorubicin, for 48 hours. Alternatively, cells were transfected with siRNA (200 nM) or plasmid (3 μg/ml), 48 hours prior to TNFα or doxorubicin exposure. XTT reagent prepared according to the manufacturer (Trevigen, Gaithersburg, MD) was added and allowed to incubate for 4 hours. Viability was determined by absorbance at 490 nm (650 nm ref.), using a Beckman Coulter Multimode DTX 880 microplate reader (Fullerton, CA). All values were normalized to the average values under control conditions.

Die Lebensfähigkeit der Zellen Assay. SH-SY5Y, U-87 MG oder LN-18-Zellen wurden in 96-Well-Kulturschalen ausgesät (5 x 103 Zellen pro Vertiefung) und für 48 Stunden gezüchtet. Die Kulturen wurden mit pharmakologischen Inhibitoren coinkubiert und entweder 100 ng / ml TNFa oder 5 pg / ml Doxorubicin, für 48 Stunden. Alternativ wurden die Zellen mit siRNA (200 nM) oder Plasmid (3 pg / ml) transfiziert, 48 Stunden vor der TNF oder Doxorubicin Exposition. XTT-Reagens, hergestellt nach dem Hersteller (Trevigen, Gaithersburg, MD) wurde zugegeben und für 4 Stunden inkubiert. Die Lebensfähigkeit wurde durch Absorption bei 490 nm (650 nm ref.) Bestimmt, unter Verwendung eines Beckman Coulter Multimode DTX 880 Mikroplattenleser (Fullerton, CA). Alle Werte wurden mit den durchschnittlichen Werten unter Kontrollbedingungen normalisiert.

Hormone Extraction We assessed two different extraction protocols on samples of approximately 0.1–0.5 g of feces. In one protocol, the sample was placed into 10 mL of an ethyl acetate : hexane (3 : 2, v/v) solution and shaken gently for 16–20 h. The solvent was then aspirated into a glass culture tube and dried under air in a 357–407C water bath in a fume hood. After drying, the residue was resuspended in 1.0 mL of gelatin-phosphate buffered saline that was allowed to incubate with gentle shaking for 1 h at room temperature, then frozen at –207C until assayed.

Hormone Extraction Wir untersuchten zwei verschiedene Extraktionsprotokolle an Proben von ca. 0,1-0,5 g Kot. In einem Protokoll, wurde die Probe in 10 ml einer Ethylacetat gegeben: Hexan (3: 2, v / v)-Lösung und schonend für 16-20 h geschüttelt. Das Lösungsmittel wurde dann in ein Glas Kulturröhrchen abgesaugt und getrocknet unter Luft in einem 357-407C Wasserbad in einem Abzug. Nach Trocknung wurde der Rückstand in 1,0 ml Gelatine-phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die gestattet, mit leichtem Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur, dann bei 207C bis zur Analyse eingefroren inkubieren resuspendiert.

Biochemical Assay Validation The efficiency of each extraction protocol was determined by spiking six to 10 individual fecal samples with 125I-corticosterone (ca. 5,000 cpm/sample) before extraction. All samples were allowed to incubate for 1 h at room temperature before initiating the appropriate extraction procedure. The specificity of the antiserum (as reported by the manufacturer) used in the assay is 100.00% for corticosterone and !1.0% for all other steroids, including deoxycorticosterone and cortisol. However, Goyman et al. (1999) have recently demonstrated that this antiserum cross-reacts with a number of fecal metabolites.

Biochemische Assay Validation Die Effizienz jeder Extraktion Protokoll wurde durch Aufstocken von sechs bis 10 einzelnen Kotproben mit 125I-Corticosteron (ca. 5.000 cpm / Probe) vor der Extraktion bestimmt. Alle Proben wurden für 1 h bei Raumtemperatur, bevor die Einleitung des entsprechenden Extraktionsverfahren inkubieren. Die Spezifität des Antiserums (wie vom Hersteller angegeben) in dem Assay verwendet wird, ist für Corticosteron 100,00% und! 1,0% für alle andere Steroide, einschließlich Desoxycorticosteron und Cortisol. Jedoch Goyman et al. (1999) haben vor kurzem gezeigt, dass dieses Antiserum kreuzreagiert mit einer Anzahl von fäkalen Metaboliten.