Solubilisierung

Verfahren zur Solubilisierung der Milch für Untersuchungszwecke.

Method for solubilising with for purposes of analysis.

Die Grenzflächenspannungswerte und die Solubilisierung von Fetten und Ölen sind hervorragend.

The surface tension values and the solubilization of fats and oils are outstanding.

Kriterium für eine gelungene Solubilisierung ist die Möglichkeit zur Sterilfiltration durch ein 0,2 µm Filter.

The criterion for successful solubilization is the possibility of sterile filtration through a 0.2 μm filter.

Nach erfolgter Solubilisierung und pH-Titration wird dann auf das vorgesehene Endvolumen aufgefüllt.

After solubilization and pH titration have taken place, the volume is then made up to the intended final volume.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die proteolytische Solubilisierung der zu identifizierenden Intermediärfilamentproteine bis maximal zur einfachen Teilung der alpha-helikalen Mittelstücke in jeweils zwei Mittelstückfragmente erfolgt.

Method according to claim 1, characterized in that the proteolytic solubilization of the intermediate filament proteins to be identified takes place to maximum the simple division of the alpha-helical central fragments into in each case two central portion fragments.

Verfahren zur Identifizierung des Differenzierungszustandes und des Ursprungs einer Zellgewebsprobe oder von Zellgewebstrümmern in Körperflüssigkeit durch Solubilisierung der in dieser Probe beziehungsweise Körperflüssigkeit vorhandenen unlöslichen Intermediärfilamentproteine in Form von löslichen Fragmenten, vorzugsweise der alpha-helikalen Mittelstücke, und Identifizierung dieser so erhaltenen oder bereits ohne zusätzliche Aufbereitung in der Probe enthaltenen Fragmente nach ihrem Ursprungsgewebetyp durch Immunreaktion mit spezifischen Antikörpern, wobei als Antikörper solche eingesetzt werden, die zur Identifizierung - vorzugsweise zur eindeutigen Identifizierung - von Intermediärfilamentproteinen nach ihrem Ursprungsgewebetyp geeignet sind und außerdem nach mehreren verschiedenen bekannten Testverfahren mit dem alpha-helikalen Mittelstück - beziehungsweise einem Epitop-tragenden Fragment davon - eines durch Rekonstitution aus gereinigten Monomeren des jeweils betreffenden Intermediärfilamentproteins gewonnenen Standards immunologisch reagieren, dadurch gekennzeichnet, daß ein Standard aus den zu identifizierenden Mittelstücken beziehungsweise Epitop-tragenden Fragmenten hergestellt wird, indem aus dem entsprechenden Gewebe oder einer geeigneten Zellkultur-Linie durch Extraktion und Reinigung die einzelnen Cytoskelett-Polypeptide isoliert werden, daß dann aus diesen Polypeptiden beziehungsweise im Falle der Cytokeratine aus einem äquimolaren Gemisch von Polypeptiden der relativ basischen (Typ II) und der sauren (Typ I) Unterfamilien als nächste Untereinheiten Dimere, sodann Tetramere und schließlich Protofilamente gebildet werden, und daß dann durch kontrollierte Verdauung mit Protease die alpha-helikalen Mittelstücke dieser Intermediärfilamente als dimere oder tetramere Komplexe freigesetzt, isoliert und gereinigt und als Standard eingesetzt werden.

Method for the identification of the differentiation state and the origin of a cellular tissue sample or cellular tissue fragments in body fluid by solubilizing the insoluble intermediate filament proteins in the form of soluble fragments and preferably alpha-helical central portions present in said sample or body fluid, and the identification of the portions obtained in this way or contained in the sample without any additional preparation in accordance with their origin tissue type by immune reaction with specific antibodies and the antibodies used are those which are suitable for identifying, preferably clearly identifying, intermediate filament proteins on the basis of their origin tissue type and also react according to several different, known test processes with the alpha-helical central portion, or an epitope-carrying fragment thereof, of a standard obtained by reconstitution from purified monomers of the particular intermediate filament protein, characterized in that a standard is prepared from the central portions or epitope-carrying fragments to be identified, in that the individual cytoskeleton polypeptides are isolated from the corresponding tissue or a suitable cell culture line by extraction and purification and that then from said polypeptides or in the case of cytokeratins from an equimolar mixture of polypeptides of the relatively basic (type II) and acid (type I) subfamilies as the next subunits are formed dimers, then tetramers and finally protofilaments and that then by controlled digestion with protease the alpha-helical central portions of these intermediate filaments are liberated as dimeric or tetrameric complexes, isolated, purified and used as a standard.

Verfahren zur Reinigung einer abnormen Form des Prion-Proteins (PrPres) aus einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (1) Inkubation der biologischen Probe für 30 Sekunden bis 2 Stunden bei einer Temperatur unter 80 °C mit einem Puffer A, der wenigstens ein Tensid in einer Menge zwischen einem Viertel und dem Vierfachen des Gewichts der biologischen Probe umfasst, unter Bildung einer Suspension S1; (2) Zugabe eines Puffers B zu der in (1) erhaltenen Suspension S1 in einer Menge, die geeignet ist, diese Suspension durch Bildung einer Mikroemulsion oder einer Mikrosuspension klar zu machen, wobei der Puffer B aus einem Lösungsmittel oder einer Lösungsmittelmischung besteht, die das PrPres nicht solubilisieren und eine Dielektrizitätskonstante zwischen 10 und 25 haben; (3) Zentrifugation der in Schritt (2) erhaltenen Suspension S2; und (4) Solubilisierung des Pellets in einem Puffer C, der wenigstens ein Tensid des gleichen Typs wie in Schritt (1) in einer Konzentration zwischen 0,1 % und 5 %, vorzugsweise zwischen 0,25 % und 1 %, bezogen auf das Volumen von Puffer C (w/v), und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel in einer Konzentration zwischen 0,1 M und 8 M umfasst, und bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 100 °C, vorzugsweise gleich oder über 80 °C. Verfahren zur Reinigung der abnormen Form des Prion-Proteins (PrPres) aus einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (1) Inkubation der biologischen Probe für 30 Sekunden bis 2 Stunden bei einer Temperatur unter 80 °C mit einem Puffer A, der wenigstens ein Tensid in einer Menge zwischen einem Viertel und dem Vierfachen des Gewichts der biologischen Probe umfasst, unter Bildung einer Suspension S1; (2) Zugabe eines Puffers B zu der in (1) erhaltenen Suspension S1 in einer Menge, die geeignet ist, eine Phasentrennung herbeizuführen, wobei der Puffer B aus einem Lösungsmittel oder einer Lösungsmittelmischung besteht, die das PrPres nicht solubilisieren und eine Dielektrizitätskonstante zwischen 10 und 25 haben; (3) Zentrifugation der in Schritt (2) erhaltenen Suspension; (4) Gewinnung des an der Phasengrenzfläche vorliegenden Films; (5) Resolubilisierung des Films mit einem Puffer A ohne Protease; (6) Zentrifugation der in Schritt (5) erhaltenen Suspension; und (7) Solubilisierung des Pellets in einem Puffer C, der wenigstens ein Tensid des gleichen Typs wie in Schritt (1) in einer Konzentration zwischen 0,1 % und 5 %, vorzugsweise zwischen 0,25 % und 1 %, bezogen auf das Volumen von Puffer C (w/v), und/oder wenigstens ein chaotropes Mittel in einer Konzentration zwischen 0,1 M und 8 M umfasst, und bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 100 °C, vorzugsweise gleich oder über 80 °C. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass wenn die biologische Probe ein Gewebe oder ein Organ ist, letzteres zuvor in Schritt (1) in einem Homogenisierungspuffer homogenisiert wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus neutralen Puffern und isotonischen Puffern.

Method of purifying abnormal form of prion protein (PrPres) from a biological sample, characterized in that it comprises: (1) the incubation, for 30 seconds to 2 hours, at a temperature below 80°C, of said biological sample with a buffer A comprising at least one surfactant in an amount of between a quarter and four times the weight of the biological sample, to form a suspension S1; (2) the addition, to said suspension S1 obtained in (1), of a buffer B in an amount suitable for clarifying said suspension by forming a microemulsion or a microsuspension, said buffer B consisting of a solvent or solvent mixture which does not solubilize the PrPres and has a dielectric constant of between 10 and 25; (3) the centrifugation of the suspension S2 obtained in step (2); and (4) the solubilization of said residue in a buffer C comprising at least one surfactant, as defined in step (1), at a concentration of between 0.1% and 5%, preferably of between 0.25% and 1%, based on the volume of buffer C (w/v), and/or at least one chaotropic agent at a concentration of between 0,1 M and 8 M, and at a temperature between room temperature and 100°C, preferably equal to or greater than 80°C. Method of purifying abnormal form of prion protein (PrPres) from a biological sample, characterized in that it comprises: (1) the incubation, for 30 seconds to 2 hours, at a temperature below 80°C, of said biological sample with a buffer A comprising at least one surfactant in an amount of between a quarter and four times the weight of the biological sample, to form a suspension S1; (2) the addition, to said suspension S1 obtained in (1), of a buffer B in an amount suitable for creating a phase separation, said buffer B consisting of a solvent or solvent mixture which does not solubilize the PrPres and has a dielectric constant of between 10 and 25; (3) the centrifugation of the suspension obtained in step (2); (4) the recovery of the film present at the interface; (5) the resolubilization of said film with a buffer A without the addition of protease; (6) the centrifugation of the suspension obtained in step (5); and (7) the solubilization of said residue in a buffer C comprising at least one surfactant, as defined in step (1), at a concentration of between 0.1% and 5%, preferably of between 0.25% and 1%, based on the volume of buffer C (w/v), and/or at least one chaotropic agent at a concentration of between 0,1 M and 8 M, and at a temperature between room temperature and 100°C, preferably equal to or greater than 80°C. Method according to claim 1 or claim 2, characterized in that , when the biological sample is a tissue or an organ, it is homogenized prior to step (1) in a homogenization buffer selected from the group consisting of neutral buffers and isotonic buffers.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Solubilisierung der Reaktionsprodukte fünfprozentige bis fünfzigprozentige Schwefelsäure in einer Menge zum dem gekühlten Reaktionsproduktgemisch zugegeben wird, bis in diesem ein pH-Wert von 1,0 erreicht ist.

Process according to Claim 1, characterized in that for solubilization of the reaction products five per cent strength to fifty per cent strength sulphuric acid is added in an amount to the cooled reaction product mixture until a pH of 1.0 is reached in the latter.