sequenzieren

Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei eine oder mehrere der folgenden Prozeduren ausgeführt wird: a. Beobachten von Verschiebungen in der elektrophoretischen Mobilität einzelsträngiger DNA aus jener Probe auf nichtdenaturierenden Polyacrylamidgelen; b. Hybridisieren einer KVLQT1-Gensonde an genomische DNA, isoliert aus jener Probe unter Bedingungen, die sich zur Hybridisierung jener Sonde an jenes Gen eignen; c. Bestimmen der Hybridisierung einer allelspezifischen Sonde an genomische DNA aus jener Probe; d. Amplifizieren des ganzen oder eines Teils des KVLQT1-Gens aus jener Probe, um eine amplifizierte Sequenz zu erzeugen, und Sequenzieren der amplifizierten Sequenz; e. Bestimmen der Anwesenheit eines spezifischen mutierten KVLQT1-Allels in jener Probe durch Nukleinsäureamplifizierung; f. molekulares Klonieren des ganzen oder eines Teils des KVLQT1-Gens aus jener Probe, um eine klonierte Sequenz zu erzeugen, und Sequenzieren der klonierten Sequenz; g. Bestimmen, ob ein Mismatch zwischen den Molekülen (1) genomischer DNA des KVLQT1-Gens oder KVLQT1-mRNA, isoliert aus jener Probe, und (2) einer Nukleinsäuresonde, die zu menschlicher Wildtyp-KVLQT1-Gen-DNA komplementär ist, besteht, wenn Moleküle (1) und (2) aneinander hybridisiert sind und damit einen Doppelstrang bilden; h. Amplifizieren von KVLQT1-Gensequenzen in jener Probe und Hybridisieren der amplifizierten Sequenzen an Nukleinsäuresonden, die Wildtyp-KVLQT1-Gensequenzen umfassen; i. Amplifizierung von KVLQT1-Gensequenzen in jenem Gewebe und Hybridisierung der amplifizierten Sequenzen an Nukleinsäuresonden, die mutierte KVLQT1-Gensequenzen umfassen; j. Untersuchen auf eine Deletionsmutation; k. Untersuchen auf eine Punktmutation; l. Untersuchen auf eine Insertionsmutation; m. Bestimmen der in-situ -Hybridisierung des KVLQT1-Gens in jener Probe mit einer oder mehreren Nukleinsäuresonden, die die KVLQT1-Gensequenz oder eine mutierte KVLQT1-Gensequenz umfassen; n. Immunoblotting; o. Immuncytochemie; p. Untersuchung auf Bindewechselwirkungen zwischen aus jenem Gewebe isoliertem KVLQT1-Gen-Protein und einem Bindepartner, der spezifisch das Polypeptid-Expressionprodukt eines mutierten Allels von KVLQT1 binden kann, und/oder einem Bindepartner für das KVLQT1-Polypeptid, das die in SEQ ID NO:2 dargestellte Aminosäuresequenz hat; und q. Untersuchen auf Inhibition der biochemischen Aktivität jenes Bindepartners.

Procédé selon la revendication 25, dans lequel un ou plusieurs des modes opératoires suivants est mis en oeuvre : a. l'observation de décalages dans la mobilité électrophorétique d'un ADN en simple brin provenant dudit échantillon sur des gels de polyacrylamide non dénaturants ; b. l'hybridation d'une sonde génique KVLQT1 à l'ADN génomique isolé dudit échantillon dans des conditions appropriées pour l'hybridation de ladite sonde audit gène ; c. la détermination de l'hybridation d'une sonde spécifique d'un allèle à l'ADN génomique provenant dudit échantillon ; d. l'amplification de tout ou partie du gène KVLQT1 provenant dudit échantillon pour produire une séquence amplifiée et le séquençage de la séquence amplifiée ; e. la détermination, par amplification d'acide nucléique, de la présence d'un allèle de mutant KVLQT1 spécifique dans ledit échantillon ; f. le clonage moléculaire de tout ou partie du gène KVLQT1 provenant dudit échantillon pour produire une séquence clonée et le séquençage de la séquence clonée ; g. l'étape consistant à déterminer s'il existe un mésappariement entre des molécules (1) ADN génomique du gène KVLQT1 ou ARNm de KVLQT1 isolé dudit échantillon, et (2) une sonde d'acide nucléique complémentaire de l'ADN du gène KVLQT1 humain de type sauvage, lorsque des molécules (1) et (2) sont hybridées l'une à l'autre pour former un duplex ; h. l'amplification des séquences du gène KVLQT1 dans ledit échantillon et l'hybridation des séquences amplifiées à des sondes d'acide nucléique qui comprennent des séquences du gène KVLQT1 de type sauvage ; i. l'amplification de séquences du gène KVLQT1 dans ledit tissu et l'hybridation des séquences amplifiées à des sondes d'acide nucléique qui comprennent des séquences du gène KVLQT1 de type mutant ; j. le dépistage d'une mutation par délétion ; k. le dépistage d'une mutation ponctuelle ; l. le dépistage d'une mutation par insertion ; m. la détermination d'une hybridation in situ du gène KVLQT1 dans ledit échantillon avec une ou plusieurs sondes d'acide nucléique qui comprennent la séquence du gène KVLQT1 ou une séquence du gène KVLQT1 de type mutant ; n. un immunotransfert ; o. une immunocytochimie ; p. la détermination d'interactions de liaison entre la protéine du gène KVLQT1 isolée dudit tissu et un partenaire de liaison capable de se lier spécifiquement au polypeptide, produit d'expression d'un allèle mutant de KVLQT1, et/ou un partenaire de liaison du polypeptide KVLQT1 ayant la séquence d'aminoacides établie dans SEQ ID NO : 2 ; et q. la détermination de l'inhibition de l'activité biochimique dudit partenaire de liaison.

Verfahren nach Anspruch 22, umfassend PCR, Ligase-Kettenreaktion, Restriktionsverdau, direktes Sequenzieren, Nucleinsäure-Amplifikationstechniken, Hybridisierungstechniken, Massenspektroskopie oder Immun-Assays.

Procédé selon la revendication 22, comprenant une PCR, une réaction de ligature en chaîne, une digestion de restriction, un séquençage direct, des techniques d'amplification des acides nucléiques, des techniques d'hybridation, une spectroscopie de masse ou des immunodosages.

Verfahren zum Sequenzieren einer Nukleinsäure durch sequentielles Bestimmen der Identität von Nukleotidanaloga nachdem die Nukleotidanaloga in einen wachsenden Strang von DNA eingebaut sind, in einer Polymerasereaktion, die die folgenden Schritte umfasst: (i) Anheften eines 5' Endes der Nukleinsäure an eine feste Oberfläche; (ii) Anheften eines Primers an die an die feste Oberfläche angeheftete Nukleinsäure; (iii) Zugeben einer Polymerase und eines oder mehrerer verschiedener Nukleotidanaloga zu der Nukleinsäure um dadurch ein Nukleotidanalogon in den wachsenden Strang von DNA einzubauen, wobei das eingebaute Nukleotidanalogon die Polymerasereaktion beendet, und wobei jedes verschiedene Nukleotidanalogon umfasst (a) eine Base ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, und Uracil, und ihrer Analoga; (b) eine eindeutige Markierung anheftet über einen spaltbaren Linker an die Base oder an ein Analogon der Base; (c) eine Desoxyribose; und (d) eine spaltbare chemische Gruppe um eine -OH-Gruppe an einer 3'-Position der Desoxyribose zu schützen, wobei die spaltbare chemische Gruppe -CH 2 OCH 3 oder -CH 2 CH=CH 2 ist; (iv) Waschen der festen Oberfläche, um nicht-eingebaute Nukleotidanaloga zu entfernen; (v) Bestimmen der Identität der eindeutigen Markierung, angehängt an das Nukleotidanalogon, das in den wachsenden Strang von DNA eingebaut worden ist, um dadurch das eingebaute Nukleotidanalogon zu identifizieren; (vi) Zugeben einer oder mehrere chemischer Verbindungen, um dauerhaft jede nicht-reagierte -OH-Gruppe auf dem Primer, angehängt an die Nukleinsäure oder auf einem Primer-Extension-Strang, gebildet durch Zugabe eines oder mehrerer Nukleotide oder Nukleotidanaloga zu dem Primer zu schützen; (vii) Spalten des spaltbaren Linkers zwischen dem Nukleotidanalogon, das in den wachsenden Strang von DNA eingebaut worden ist, und der eindeutigen Markierung; (viii) Spalten der spaltbaren chemischen Gruppe, die die -OH-Gruppe an der 3'-Position der Desoxyribose schützt, um die -OH-Gruppe zu entschützen, und Waschen der festen Oberfläche um gespaltene Verbindungen zu entfernen; und (ix) Wiederholen der Schritte (iii) bis (viii), um für jede Wiederholung, die Identität des neu eingebauten Nukleotidanalogons in den wachsenden Strang von DNA zu bestimmen; wobei, wenn die eindeutige Markierung ein Farbstoff ist, die Reihenfolge, in welcher die Schritte (v) bis (vii) durchgeführt werden: (v), (vi) und (vii) ist; und wenn die eindeutige Markierung ein Massen-Tag ist, die Reihenfolge, in welcher die Schritte (v) bis (vii) durchgeführt werden: (vi), (vii) und (v) ist.

Procédé de séquençage d'un acide nucléique par détermination séquentielle de l'identité d'analogues nucléotidiques après que les analogues nucléotidiques ont été incorporés dans un brin en croissance d'ADN dans une réaction de polymérase, qui comprend les étapes suivantes : (i) attacher une extrémité 5' de l'acide nucléique à une surface solide ; (ii) attacher une amorce à l'acide nucléique attaché à la surface solide ; (iii) ajouter une polymérase et un ou plusieurs analogues nucléotidiques différents à l'acide nucléique pour incorporer ainsi un analogue nucléotidique dans le brin en croissance d'ADN, dans lequel l'analogue nucléotidique incorporé interrompt la réaction de polymérase et dans lequel chaque analogue nucléotidique différent comprend (a) une base choisie dans le groupe constitué par l'adénine, la guanine, la cytosine, la thymine et l'uracile, et leurs analogues ; (b) un marqueur unique attaché par le biais d'un lieur clivable à la base ou à un analogue de la base ; (c) un désoxyribose ; et (d) un groupe chimique clivable pour coiffer un groupe -OH à une position 3' du désoxyribose, dans lequel le groupe chimique clivable est -CH 2 OCH 3 ou -CH 2 CH=CH 2 ; (iv) laver la surface solide pour retirer les analogues nucléotidiques non incorporés ; (v) déterminer l'identité du marqueur unique attaché à l'analogue nucléotidique qui a été incorporé dans le brin en croissance d'ADN, de manière à identifier ainsi les analogues nucléotidiques incorporés ; (vi) ajouter un ou plusieurs composés chimiques pour coiffer en permanence tout groupe -OH n'ayant pas réagi sur l'amorce attachée à l'acide nucléique ou sur un brin d'extension de l'amorce formé en ajoutant un ou plusieurs nucléotides ou analogues nucléotidiques à l'amorce ; (vii) cliver le lieur clivable entre l'analogue nucléotidique qui a été incorporé dans le brin en croissance d'ADN et le marqueur unique ; (viii) cliver le groupe chimique clivable coiffant le groupe -OH à la position 3' du désoxyribose pour décoiffer le groupe -OH, et laver la surface solide pour retirer les composés clivés ; et (ix) répéter les étapes (iii) à (viii) de manière à déterminer, pour chaque répétition, l'identité de l'analogue nucléotidique nouvellement incorporé dans le brin en croissance d'ADN ; dans lequel, si le marqueur unique est un colorant, l'ordre dans lequel les étapes (v) à (vii) sont effectuées est : (v), (vi) et (vii) ; et si le marqueur unique est un marqueur de masse, l'ordre dans lequel les étapes (v) à (vii) sont effectuées est : (vi), (vii) et (v).